反相色譜柱具有硅膠和聚苯乙烯色譜柱二者的優點，并且摒棄了這兩種色譜柱的缺點。以乙烯醇共聚物為基質的色譜柱，即使其載炭量很高也能保持表面的濕潤。多孔結構具有足夠大的平均孔徑，對小分子化合物、多肽和小分子蛋白能夠產生理想的分離效果。在有機溶劑比例較高的流動相中，該柱具有與硅膠基質色譜柱相同的柱效，但在堿性緩沖溶液為流動相條件下，其分離效率則超過硅膠色譜柱。顯著的特點之一是基質被烷基化的填料的洗脫順序，其保留能力與碳鏈長度成正比。
反相色譜柱的活化步驟：
1、應先使用20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱；
2、若流動相含有緩沖鹽，用跟流動相中鹽相等比例的超純水和有機相沖洗過渡。用量為20倍柱體積，再用含緩沖鹽的流動相平衡色譜柱，用量為20倍柱體積或以上；
3、若流動相不含緩沖鹽，用流動相平衡色譜柱，用量為20倍柱體積或以上；
4、到壓力基線平穩，若不平穩可延長平衡時間。
優化反相色譜柱的條件：
在確定了色譜柱規格、合適的固定相柱填料、流動相溶劑和改性劑后，即可開始優化方法。方法的優化是根據目標決定的。如果要開發質量控制方法，您可能會需要像等度分離這種可變因素較少的方法。如果目標是得到較高分離度，節省分析時間并不是首要問題，可以選擇長柱使所有組分都得到較大分離度。如果分離速度很重要，則應使用短柱和高流速。對于含許多保留不同的目標化合物的復雜樣品，用等度分離可能不能解決問題，應開發并優化梯度方法。
按約定俗成將水相溶劑和反相色譜中較弱的溶劑稱為流動相“A”，“B”溶劑是有相組成較高和較強的溶劑。在反相色譜模式中，當增加B的百分比時，通常保留將減少。請注意，在還沒有開發出樣品的實際分析方法前，大部分人開發HPLC方法都是采用“反復實驗”的方法，即，嘗試各種不同流動相條件，以找出較佳條件。
