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水產品中27種性激素的檢測SPE-HPLC法
參考《GB 31656.14-2022 食品安全國家標準 水產品中27種性激素殘留量的測定 液相色譜串聯質譜法》
激素類藥物是人和動物疾病診療的常用藥物，但不合理的使用會給人和動物健康造成危害。為此，農業部相繼發布了《禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》(農業部公告第176號)、《禁止在飼料和動物飲水中使用的物質名單》(農業部公告第1519號)、《食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》(農業農村部公告第250號)等公告，禁止性激素等多種激素類藥物用于食品動物。
GB 31656.14-2022《食品安全國家標準 水產品中27種性激素殘留量的測定 液相色譜串聯質譜法》由中華人民共和國農業農村部、中華人民共和國國家衛生健康委員會和國家市場監管總局于2022年9月20日通過第594號公告發布，自2023年2月1日起實施，并在其第一號修改單中將附錄A表A.1中17-α-羥基孕酮的英文名稱“17A-acetoxyprogesterone”、分子式“C23H32O4”、CAS號“302-23-8”，修改為英文名稱“17α-Hydroxyprogesterone”、分子式“C21H30O3” 、CAS號“68-96-2”。該標準檢測范圍包含了己二烯雌酚、己烯雌酚、己烷雌酚、雌酮、雌二醇、雌三醇、炔雌醇、苯甲酸雌二醇、17-α羥基孕酮、21-α羥基孕酮、醋酸甲羥孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、左炔諾孕酮、甲羥孕酮、諾龍、苯丙酸諾龍、睪酮、勃地酮、孕酮、群勃龍、甲基睪酮、雄烯二酮、美雄酮、炔諾酮、康力龍、丙酸睪酮共27種性激素。
迪馬科技參考GB 31656.14-2022《食品安全國家標準 水產品中27種性激素殘留量的測定 液相色譜串聯質譜法》及其第一號修改單重現了此方法，使用HPLC-MS/MS法，乙酸乙酯和甲基叔丁基醚提取，ProElut® C18-U和ProElut® Silica SPE小柱凈化提取液，Spursil® C18-EP 5μm色譜柱分離，內標法定量，測試了草魚、海蝦、海螃蟹樣品的可食部分，添加回收率在60%-120%，符合標準要求。
本方案適用草魚、海蝦、海螃蟹可食部分己二烯雌酚、己烯雌酚、己烷雌酚、雌酮、雌二醇、雌三醇、炔雌醇、苯甲酸雌二醇、17-α羥基孕酮、21-α羥基孕酮、醋酸甲羥孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、左炔諾孕酮、甲羥孕酮、諾龍、苯丙酸諾龍、睪酮、勃地酮、孕酮、群勃龍、甲基睪酮、雄烯二酮、美雄酮、炔諾酮、康力龍、丙酸睪酮的檢測。
(1)27種性激素混合標準儲備液：迪馬標準品部提供(Cat.#: 48337)；
(2)混合標準中間液Ⅰ：準確吸取0.1mL混合標準儲備液，用甲醇定容至10mL，配制成己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、17-α羥基孕酮、21-α羥基孕酮、醋酸甲羥孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、甲羥孕酮、諾龍、苯丙酸諾龍、睪酮、勃地酮、孕酮、群勃龍、甲基睪酮、雄烯二酮、美雄酮、丙酸睪酮終濃度1μg/mL，己烷雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇、左炔諾孕酮、炔諾酮、康力龍終濃度2μg/mL，雌三醇、炔雌醇終濃度4μg/mL的混合標準溶液；
(3)混合標準中間液Ⅱ：準確吸取0.2mL混合標準儲備液，用甲醇定容至1mL，配制成己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、17-α羥基孕酮、21-α羥基孕酮、醋酸甲羥孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、甲羥孕酮、諾龍、苯丙酸諾龍、睪酮、勃地酮、孕酮、群勃龍、甲基睪酮、雄烯二酮、美雄酮、丙酸睪酮終濃度0.2μg/mL，己烷雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇、左炔諾孕酮、炔諾酮、康力龍終濃度0.4μg/mL，雌三醇、炔雌醇終濃度0.8μg/mL的混合標準溶液；
(4)混合內標工作液：分別準確吸取內標儲備液，用甲醇稀釋至雌二醇-13C2濃度2μg/mL，己烯雌酚-D8、雌酮-D2、甲基睪酮-D3、孕酮-D9、甲羥孕酮-D3、左炔諾孕酮-D6濃度1μg/mL。
稱取試樣5g，于50mL離心管中，準確加入30μL混合內標工作液和乙酸-乙酸鈉緩沖液10mL，渦旋30s，加乙酸乙酯-甲基叔丁基醚溶液10mL，渦旋1min，超聲10min，渦旋混合1min，于8000r/min離心8min，取上層有機相于100mL梨形瓶；殘渣用乙酸乙酯10mL重復提取1次，有機相合并至梨形瓶中，于35℃水浴旋轉蒸發至干，氮吹旋蒸瓶中剩余油脂，將乙酸乙酯吹除干凈，加入正己烷7mL溶解殘留物，待凈化。
乙酸-乙酸鈉緩沖溶液：取13.0g無水乙酸鈉，冰乙酸2.6mL，用水定容到500mL。
乙酸乙酯-甲基叔丁基醚溶液：取乙酸乙酯和甲基叔丁基醚等體積混合。
草魚樣品：
ProElut® C18-U 500mg/3mL (Cat.#: 63504)
(1)活化：依次用5mL甲醇、5mL正己烷活化；
(2)上樣：加入待凈化液，流速控制不超過1秒/滴；
(3)淋洗：加入10mL正己烷；
(4)洗脫：加入10mL甲醇，收集洗脫液；于40℃水浴旋轉蒸發至干；
(5)重新溶解：準確加入甲醇0.85mL，渦旋混合1min，再準確加入水0.15mL，混合30s，8000r/min離心6min，上清液用0.22μm尼龍濾膜過濾，待測。
海蝦、海螃蟹樣品：
ProElut®C18-U/Silica/500mg/500mg/6mL
(1)活化：依次用5mL甲醇、5mL正己烷活化；
(2)上樣：加入待凈化液，流速控制不超過1秒/滴；
(3)淋洗：加入10mL正己烷；
(4)洗脫：加入10mL甲醇，收集洗脫液；于40℃水浴旋轉蒸發至干；
(5)重新溶解：準確加入甲醇0.85mL，渦旋混合1min，再準確加入水0.15mL，混合30s，8000r/min離心6min，上清液用0.22μm尼龍濾膜過濾，待測。
注：同方法制備基質匹配標準溶液
(1)HPLC條件
色譜柱：Spursil® C18-EP, 150x4.6mm, 5μm (Cat.#: 82101)
流速：0.4mL/min
進樣量：10μL
柱溫：30℃
流動相：A: 0.02%氨水 B:甲醇
梯度設置：
(2)質譜條件
電離模式：ESI
掃描方式：正/負離子掃描
檢測方式：多反應監測
電噴霧電壓：5500/-4500V
霧化氣壓力：50psi
輔助氣壓力：50psi
氣簾氣壓力：20psi
離子源溫度：500℃
定性離子對、定量離子對、碰撞氣能量及去簇電壓見下表
(1)草魚
(2)海蝦
(3)海螃蟹
標準品己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、17-α羥基孕酮、21-α羥基孕酮、醋酸甲羥孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、甲羥孕酮、諾龍、苯丙酸諾龍、睪酮、勃地酮、孕酮、群勃龍、甲基睪酮、雄烯二酮、美雄酮、丙酸睪酮濃度5ng/mL，己烷雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇、左炔諾孕酮、炔諾酮、康力龍濃度10ng/mL，雌三醇、炔雌醇濃度20ng/mL，雌二醇-13C2濃度60ng/mL，己烯雌酚-D8、雌酮-D2、甲基睪酮-D3、孕酮-D9、甲羥孕酮-D3、左炔諾孕酮-D6濃度30ng/mL檢測的XIC圖
標準品己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、17-α羥基孕酮、21-α羥基孕酮、醋酸甲羥孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、甲羥孕酮、諾龍、苯丙酸諾龍、睪酮、勃地酮、孕酮、群勃龍、甲基睪酮、雄烯二酮、美雄酮、丙酸睪酮濃25ng/mL，己烷雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇、左炔諾孕酮、炔諾酮、康力龍濃度50ng/mL，雌三醇、炔雌醇濃度100ng/mL，雌二醇-13C2濃度60ng/mL，己烯雌酚-D8、雌酮-D2、甲基睪酮-D3、孕酮-D9、甲羥孕酮-D3、左炔諾孕酮-D6濃度30ng/mL檢測的XIC圖
標準品己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、17-α羥基孕酮、21-α羥基孕酮、醋酸甲羥孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、甲羥孕酮、諾龍、苯丙酸諾龍、睪酮、勃地酮、孕酮、群勃龍、甲基睪酮、雄烯二酮、美雄酮、丙酸睪酮濃度100ng/mL，己烷雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇、左炔諾孕酮、炔諾酮、康力龍濃度200ng/mL，雌三醇、炔雌醇濃度400ng/mL，雌二醇-13C2濃度60ng/mL，己烯雌酚-D8、雌酮-D2、甲基睪酮-D3、孕酮-D9、甲羥孕酮-D3、左炔諾孕酮-D6濃度30ng/mL檢測的XIC圖
標準品己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、17-α羥基孕酮、21-α羥基孕酮、醋酸甲羥孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、甲羥孕酮、諾龍、苯丙酸諾龍、睪酮、勃地酮、孕酮、群勃龍、甲基睪酮、雄烯二酮、美雄酮、丙酸睪酮濃度5ng/mL，己烷雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇、左炔諾孕酮、炔諾酮、康力龍濃度10ng/mL，雌三醇、炔雌醇濃度20ng/mL，雌二醇-13C2濃度60ng/mL，己烯雌酚-D8、雌酮-D2、甲基睪酮-D3、孕酮-D9、甲羥孕酮-D3、左炔諾孕酮-D6濃度30ng/mL的定量離子色譜圖
更多譜圖詳見迪馬科技。
(1)草魚、海蝦、海螃蟹樣品，27種性激素添加回收率60%-120%，符合標準要求；
(2)苯甲酸雌二醇和孕酮不同于標準，選擇了加NH4峰，響應強度更高，便于定量；
(3)海蝦和海螃蟹樣品凈化小柱多加一層Silica吸附填料，可以避免這類比較臟樣品上樣時過載導致的己二烯雌酚和己烷雌酚流失、回收率異常的現象，提高回收結果。
下載方案